Методичні рекомендації до лабораторних робіт) Київ 2001 удк 576. 8 (075. 8)

Київ - 2001

З М І С Т
Організація мікробіологічної лабораторії. Правила роботи у мікробіологічній лабораторії. Стерилізація. Дезінфекція…..………..	4
Організація мікробіологічної лабораторії……………………………... Правила роботи у мікробіологічній лабораторії………………………. Стерилізація………………………………………………………………	4 4 5
Харчові потреби мікроорганізмів. Поживні середовища……...……....	11
Харчові потреби мікроорганізмів……………………………………… Поживні середовища…………………………………………………….	11 12
Культивування мікроорганізмів у лабораторних умовах……...……..	15
Способи культивування аеробних мікроорганізмів в лабораторних умовах……………………………………………………………………. Способи культивування анаеробних мікроорганізмів………………...	16 16
Культуральні властивості мікроорганізмів та методи їх мікроскопічних досліджень ………………………………….….……..…	18
Культуральні властивості мікроорганізмів……………………………. Будова оптичного мікроскопу………………………………………….. Виготовлення препаратів для мікроскопії……………………………...	18 19 22
Морфологія бактерій…………..……………….…………………………..	26
Морфологічні форми грибів, дріжджів та актиноміцетів………...….	33
Актиноміцети……………………………………………………………. Гриби……………………………………………………………………...	33 36
Ультраструктура бактеріальної клітини…..……………………………	41
Поширення мікроорганізмів у природі……………..……..…………….	52
Мікрофлора грунту……………………………………………………… Мікрофлора води………………………………………………………... Мікрофлора повітря……………………………………………………... Нормальна мікрофлора організму людини…………………………….	52 53 53 54
Взаємовідносини між мікроорганізмами. Антибіотики…….…………	57
Практичне використання мікроорганізмів……………………………..	60
“Мікробіологія” (Програма нормативного курсу) ……………..……...	62
Додаток………………………………………………………………………	67

1. 
   Миєчну кімнату, де проводиться миття та висушування лабораторного посуду.
   
2. 
   Препараторську, в якій готується лабораторний посуд, реактиви та поживні середови­ща для культивування мікроорганізмів.
   
3. 
   Автоклавну (стерилізаційну), де встановлені автоклави для стерилізації лабораторного посуду, поживних середовищ та проводиться знешкодження відпрацьованого інфіко­ваного матеріалу.
   
4. 
   Матеріальну кімнату, для збереження запасу реактивів, посуду та господарського інвентарю.
   
5. 
   Лабораторну (учбову) кімнату, де проводяться мікробіологічні дослідження. Лабора­торна кімната повинна мати:
   

• 
  лабораторні столи, покриті матеріалом, який легко миється й піддається обробці дезінфікуючими розчинами. Робочі місця повинні бути обладнані газовими пальни­ками, штативами для бактеріальних петель та пробірок, дезінфікуючим розчином;
  
• 
  мікроскопи з імерсійною системою;
  
• 
  необхідний набір реактивів та барвників;
  
• 
  бактерицидні лампи.
  

1. 
   Працювати в лабораторії у халаті й головному уборі (косинка, шапочка).
   
2. 
   У приміщенні лабораторії не приймати їжу й воду, не допускати зайвих роз­мов і непотрібних переходів. Працювати сидячи.
   
3. 
   Користуватися лише своїм робочим місцем і прикріпленим до нього обладнан­ням.
   
4. 
   Всі посіви мають бути підписані.
   
5. 
   Під час роботи підтримувати чистоту та порядок. Всі реактиви та барвники ставити на свої місця, не класти на столи пробки від пробірок, піпетки, бакте­ріологічні петлі.
   
6. 
   Використані піпетки, предметні й покривні скельця, шпателя і т.д. поміщають у дезінфікуючий розчин. Пінцети, бактеріологічні петлі фламбують у полум’ї пальника і ставлять у штатив.
   
7. 
   Усі використані матеріали (відпрацьовані пробірки з культурами мікроорга­нізмів, інфіковані матеріали) знешкоджують в автоклаві. Ця робота викону­ється співробітниками лабораторії.
   
8. 
   Поверхню столів, одягу, взуття та інших предметів, які випадково забрудни­лися досліджуваним матеріалом (розбилася пробірка, упала крапля), дезінфі­кують.
   
9. 
   Після закінчення роботи поставити в термостат засіяні чашки й пробірки. Культури мікроорганізмів і залишки досліджуваного матеріалу необхідно зда­ти викладачеві, а робоче місце привести в порядок і продезінфікувати.
   
10. 
    Проводити вологе прибирання і періодичну дезінфекцію всіх робочих при­міщень.
    

1. 
   Дії високих температур:
   

• 
  прожарювання (фламбування) у полум’ї газового пальника;
  

• 
  кип'ятіння;
  
• 
  сухим жаром у сухожарових шафах;
  

• 
  автоклавування.
  

2. 
   Стерилізації фільтруванням.
   
3. 
   Опромінення ультрафіолетовими променями.
   

1. 
   ^ Прожарюванням (фламбуванням) у полум’ї газового пальника стерилізують, безпо­середньо перед використанням, платинові петлі, голки та дрібні металеві предмети. При цьому необхідно пам’ятати, що найвища температура спостерігається у верхній та периферійних частинах полум’я пальника (рис. 1).
   

2. 
   Кип'ятінням стерилізують дрібні металеві та скляні інструменти. Початком стерилі­зації вважають момент закипання води у стерилізаторі.
   
3. 
   Стерилізацію сухим жаром проводять у спеціальних сухожарових шафах. Таким чи­ном стерилізують, в основному, лабораторний посуд, який складають у спеціальні бік­си або загортають у папір. При встановленні на сухожарових шафах температури, слід пам’ятати, що папір та ватно-марлеві пробки обвуглюються при температурі понад 180⁰ С.
   
4. 
   Стерилізація автоклавуванням – це найбільш надійний та поширений спосіб стери­лізації. ЇЇ проводять за допомогою спеціальних пристроїв – автоклавів (рис. 2). В автоклавах стерилізують посуд, поживні середовища та проводять знешкодження від­працьованого матеріалу.
   

1. 
   Галогени (хлор, йод) та їх похідні. Хлор та йод активні проти вегетативних та спо­рових форм мікроорганізмів.
   
2. 
   Сполуки важких металів (ртуть, срібло, мідь). Так як сполуки ртуті високотоксичні, а срібла – коштовні, їх використовують дуже рідко. Крім того, ці сполуки здійснюють переважно бактеріостатичну, а не бактерицидну дію.
   
3. 
   Фенольні сполуки. Фенол здійснює дезінфікуючий вплив як на вегетативні клітини, так і на спори, тоді як його сполуки неефективні проти спор.
   
4. 
   Спирти (етиловий та ізопропіловий). Їх дезінфікуючі властивості зростають прямо пропорційно концентрації, від 50⁰ до 70⁰. При більш високих концентраціях їх бак­терицидна дія різко знижується. Спирти не здійснюють летального впливу на спори бактерій і мають повільний дезінфікуючий ефект (декілька хвилин).
   
5. 
   Мікробоцидні гази. Формальдегід – максимальний стерилізаційний ефект досягається при вологості повітря 70% і температурі 22⁰ С. При більш низькій температурі він втрачає свій дезінфікуючий ефект. Оксидом етилену обробляють термолабільні сере­довища та пластмасовий посуд. Оксид етилену летка сполука і виділяється з оброб­леного матеріалу при температурі 37⁰ С.
   
6. 
   Консерванти додають до середовищ та матеріалів, які підлягають тривалому збері­ганню.
   

1. 
   Ознайомитися із приміщеннями учбової мікробіологічної лабораторії, охороною праці та технікою безпеки.
   
2. 
   Виготовити ватно-марлеві пробки для бактеріологічних пробірок та колб.
   
3. 
   Виготовити скляні шпателі.
   
4. 
   Підготувати для стерилізації лабораторний посуд: пробірки, чашки Петрі, піпетки та колби.
   

1. 
   Ватно-марлеві пробки можна виготовляти вручну або за допомогою спеціальних ма­шин. Правильно виготовлена пробка повинна легко (але щільно) входити у колбу (пробірку). При різкому вийманні такої пробки відчувається легенький хлопок.
   
2. 
   Шпателі для мікробіологічних досліджень краще виготовляти зі скляних паличок дов­жиною 18-20 см і товщиною 0,4 см.
   
3. 
   При підготовці до стерилізації бактеріологічні пробірки (чисті та висушені) закри­вають ватно-марлевими пробками, а потім загортають по 20-25 штук у папір. Чашки Петрі загортають у папір по 1-3 штуці.
   

1. 
   Які кімнати повинна містити мікробіологічна лабораторія?
   
2. 
   Які методи стерилізації ви знаєте?
   
3. 
   Які режими використовують при стерилізації в автоклаві?
   
4. 
   Яка будова автоклава?
   
5. 
   У чому полягає суть хімічних методів стерилізації?
   
6. 
   Що таке стерилізація, дезінфекція, пастеризація? Чим вони відрізняються між собою?
   

• 
  бути поживними, тобто вони повинні задовольняти всі необхідні харчові потреби мікроорганізмів;
  
• 
  містити необхідну кількість води;
  
• 
  мати певні значення pH та Eh;
  
• 
  бути ізотонічними;
  
• 
  бути стерильними;
  
• 
  бути прозорими.
  

• 
  загальновживані середовища, на яких ростуть і розвиваються представники різ­них груп мікроорганізмів (наприклад, МПА, МПБ, пептонна вода). Вони викорис­товуються для культивування мікроорганізмів та накопичення біомаси;
  
• 
  середовища спеціального призначення, серед яких виділяють:
  

1. 
   Елективні середовища, які забезпечують розвиток певних груп мікроорганізмів (нап­риклад, середовища, які не містять зв’язаних форм азоту – для виділення азотфіксу­ючих бактерій).
   
2. 
   Селективні середовища призначені для селекції мікроорганізмів за певною ознакою (наприклад, стійкість до антибіотика).
   
3. 
   Диференційно-діагностичні поживні середовища (індикаторні) дають можливість швидко відрізнити одні види мікроорганізмів від інших або виявити деякі їх особли­вості. Наприклад, середовище Ендо, яке дозволяє виявити наявність клітин Escherichia coli у природних субстратах, так як лише E. coli на цьому середовищі утворює колонії рожевого кольору з металевим блиском.
   

1. 
   Виготовити поживні середовища:
   

• 
  пептонну воду – 100 мл;
  
• 
  м’ясо-пептонний агар (МПА) – 500 мл;
  
• 
  середовище Чапека – 200 мл;
  
• 
  середовище Ешбі – 200 мл.
  

1. 
   Назвіть макро- та мікроелементи, які повинно містити поживне середовище.
   
2. 
   Що таке фактори росту та за яких умов їх додають у поживне середовище?
   
3. 
   На які групи поділяють мікроорганізми в залежності від джерела вуглецю?
   
4. 
   Що являє собою агар-агар та які його фізичні характеристики?
   
5. 
   Чому желатин має обмежене використання для ущільнення поживних середовищ?
   
6. 
   Яким вимогам повінні відповідати поживні середовища?
   
7. 
   Як класифікують поживні середовища в залежності від походження, призначення та консистенції?
   

• 
  мезофіли – ростуть в діапазоні температур 20-40⁰ С. Для водних та ґрунтових мікроорганізмів температурний оптимум 20-30⁰ С. Для бактерій шкіри та слизових оболонок кишок– 35-38⁰ С;
  
• 
  термофіли – ростуть при температурі вище 45⁰ С;
  
• 
  психрофіли – ростуть при температурі нижче 20⁰ С. Оптимум 5-10⁰ С.
  

• 
  аероби – життєдіяльність яких відбувається за рахунок окислення речовин киснем повітря;
  
• 
  анаероби – отримують кисень при анаеробному розщепленні складних органічних сполук. Атмосферний кисень при цьому смертельний;
  
• 
  мікроаерофіли (факультативні аероби та анаероби) – потребують умов із зниженим рівнем кисню.
  

1. 
   Розплавити щільні поживні середовища.
   
2. 
   Розлити поживні середовища:
   

• 
  пептонну воду у пробірки;
  
• 
  МПА у пробірки (стовпчиком та у вигляді скошеної поверхні) та чашки Петрі.
  

3. 
   Засіяти:
   

• 
  штрихом на чашку Петрі з МПА – Staphylococcus aureus;
  
• 
  штрихом у пробірку зі скошеним МПА – Micrococcus luteus;
  
• 
  уколом в стовпчик у пробірку з МПА – Serratia marcescens;
  
• 
  піпеткою у пробірку з пептонною водою – Bacillus subtilis.
  

1. 
   Які умови необхідно забезпечити для нормального вирощування мікроорганізмів?
   
2. 
   На які групи поділяються мікроорганізми в залежності від відношення до температу­ри?
   
3. 
   Як забезпечити вирощування аеробних та анаеробних форм мікроорганізмів?
   
4. 
   Яка техніка посіву на рідкі та щільні поживні середовища?