Методичні рекомендації до лабораторних робіт) Київ 2001 удк 576. 8 (075. 8)
Скачати 1.04 Mb.
|
| МІЖНАРОДНИЙ СОЛОМОНІВ УНІВЕРСИТЕТ М.Г.Сергійчук, Т.М.Фурзікова М І К Р О Б І О Л О Г І Я (методичні рекомендації до лабораторних робіт)  Київ - 2001УДК 576.8 (075.8) Сергійчук М.Г., Фурзікова Т.М. Мікробіологія (методичні рекомендації до лабораторних робіт). – Київ,____________, 66 с. У методичних рекомендаціях представлено коротку характеристику об’єктів мікробіології та описання основних методів роботи з мікроорганізмами. Викладені методи мікроскопічних досліджень, принципи виготовлення поживних середовищ і культивування мікроорганізмів, способи стерилізації. Наведені рецепти реактивів, барвників та поживних середовищ, які найбільш часто використовуються у мікробіологічній практиці. Методичні рекомендації розраховані для студентів біологічних факультетів вищих учбових закладів. Затверджено до друку Радою Міжнародного Соломонова університету ________________________ 2001 р. Рецензент кафедра мікробіології та загальної імунології Київського національного університету імені Тараса Шевченка (зав. кафедри проф. Позур В.К.)
Лабораторна робота 1 Організація мікробіологічної лабораторії. Правила роботи у мікробіологічній лабораторії. Стерилізація. Дезінфекція Організація мікробіологічної лабораторії Мікробіологічна лабораторія повинна бути ізольована від інших підрозділів і включати такі приміщення:
Інші кімнати організовуються за необхідністю (центрифужна, віварій, кімната для відпочинку та ін.). Правила роботи у мікробіологічній лабораторії Співробітники мікробіологічних лабораторій та студенти, на лабораторних заняттях, повинні пам’ятати, що вони працюють із культурами мікроорганізмів, які не завжди є нешкідливими для здоров’я людини. Тому, при роботі в мікробіологічній лабораторії, або на лабораторних заняттях з мікробіології необхідно завжди дотримуватись правил безпеки:
Стерилізація Стерилізація (від лат. sterilis – безплідний) – це повне знешкодження матеріалу від вегетативних клітин мікроорганізмів та їх форм спокою (спор, цист…). Для стерилізації використовують різні методи, які можна поділити на дві основні групи – фізичні та хімічні. Фізичні методи стерилізації передбачають застосування:
Хімічні методи стерилізації передбачають використання бактерицидних газів та розчинів деяких хімічних речовин (спирт, сулема…). Фізичні методи стерилізації Дія високих температур:
 Автоклави можуть бути різноманітні за формою, розмірами, робочим тиском, конструкцією, але всі вони виконують одну і ту ж функцію – стерилізацію, і принцип їх роботи – практично однаковий. У верхній двостінний металевий резервуар, який герметично закривається, складають матеріал, який підлягає стерилізації. Нижній резервуар представляє собою котел, який заповнюється водою. Необхідний рівень води відмічено на спеціальній водомірній трубці автоклава. Верхній та нижній резервуари з’єднані між собою трубкою, по якій піднімається пара при закипанні води у котлі. Пара збирається у верхньому резервуарі і, так як він герметично закритий, в ньому створюється надлишок тиску. Для того щоб надлишковий тиск не перевищував дозволеної межі, верхній резервуар оснащено спеціальним паровивідним клапаном. Автоклав обов’язково має два манометри, на одному – встановлюється необхідний для стерилізації тиск, інший – показує поточний тиск у стерилізаційній камері. Як тільки стрілка манометра доходить встановленої позначки, автоматично відкривається паровипускний клапан і надлишок пари виходить із стерилізаційної камери. В мікробіологічній практиці стерилізація в автоклаві здійснюється при температурі в межах від 1120 С до 1340 С, тобто від 0,5 до 2,0 атм. Температура нижче 1120 С не є надійною, а вище 1340 С – не є необхідною. Показнику манометра, у фізичних атмосферах, відповідає певна температура (таб. 1). Температура й тривалість автоклавування визначаються матеріалом, який стерилізується. Поживні середовища, які містять молоко, желатин, пивне сусло, дріжджовий автолізат, вітаміни, цукри стерилізують при 0,5 атм. протягом 15-30 хв. Загальновживані поживні середовища стерилізуються при 1,0 атм. Але є субстрати, які характеризуються особливою термостабільністю (наприклад, ґрунт), Такі субстрати стерилізують при 2,0 атм. протягом 1-2 год два дні підряд. ^
Для середовищ, складові яких руйнуються при температурі вище 1000 С, проводять поетапну (дрібну) стерилізацію, яку можна здійснювати в автоклаві з відкритим паровипускним клапаном (стерилізація текучою парою). Принцип такої стерилізації полягає в тому, що середовище (чи його компоненти) прогрівається без надлишкового тиску (при 1000 С) декілька разів, а в періоди між прогріваннями дають можливість прорости життєздатним спорам. Обробку текучою парою проводять 3-4 рази протягом 20-40 хв. Різновидом дрібної стерилізації є тиндалізація. Використовується для середовищ, компоненти яких денатуруються при 600 С. Матеріал, який стерилізується прогрівають на водяних банях та апаратах Коха 5-6 разів, із перервою для переходу спорових форм мікроорганізмів у вегетативні. Одноразовий прогрів матеріалу при температурі нижче 1000 С, направлений на знищення лише вегетативних клітин мікроорганізмів, називають пастеризацією. Вона, як правило, не забезпечує стерильності. В результаті пастеризації гине до 90-95% мікрофлори. Ті ж клітини, які залишилися – ослаблені і розмножуються повільніше. Пастеризація широко використовується у харчовій промисловості для обробки продуктів, які швидко втрачають (змінюють) свої смакові і харчові властивості при розвитку в них мікроорганізмів: молоко, ягідні та фруктові соки, вина, пиво та ін. Пастеризацію проводять при 60-750 С протягом 15-30 хв або при 800 С – 10-15 хв (у деяких випадках матеріал нагрівають до 900 С) із наступним швидким охолодженням до температури нижче 100 С. Стерилізація фільтруванням використовується для обробки поживних середовищ та розчинів, компоненти яких розкладаються під дією температури. Метод полягає у пропусканні (фільтрації) розчинів через дрібнопористі фільтри (табл. 2). Мікробні клітини затримуються на фільтрах механічно, так як вони більші, ніж діаметр пор фільтру. В залежності від матеріалу, із якого виготовлено фільтр, розрізняють мембранні (колоїдні), азбестові, фарфорові, скляні фільтри. Фільтрування проводять за допомогою спеціальних приладів (фільтри Зейтца, свіча Шамберлана) (рис. 3). Механізм роботи цих приладів принципово подібний. Верхній отвір стерильної колби покривається мікропористим фільтром, через який пропускається рідина, яку треба простерилізувати. Але пори фільтра настільки малі, що ця рідина не здатна проходити крізь них самостійно, для цього необхідно створити різницю тисків ззовні колби та в середині. За допомогою спеціального насоса у колбі створюється вакуум і простерилізована, таким чином, рідина збирається у колбі. Таблиця 2 Характеристика мембранних фільтрів “Сінпор”
 Опромінення ультрафіолетовими променями використовується, як правило, для обробки повітря в кімнатах, які потребують особливої чистоти. Хімічні методи стерилізації Хімічна стерилізація (дезінфекція) – це знищення мікроорганізмів та їх спор за допомогою хімічних речовин (антисептиків). Найчастіше дезінфекцію проводять для знищення патогенних форм мікроорганізмів у навколишньому середовищі. Як дезінфікуючі агенти використовують:
Окремо можна виділити біологічну стерилізацію, яку здатні здійснювати антибіотичні речовини та фітонциди. Практичне завдання:
Хід роботи:
Матеріали та обладнання: Піпетки об’ємом 1 мл, 2 мл та 5 мл (по дві на кожного студента), піпетки об’ємом 1 мл, 2 мл та 5 мл (по дві на кожного студента), чашки Петрі (по дві на кожного студента), колби різних розмірів, скляні палички (по дві на кожного студента), бактеріологічні пробірки (по дві на кожного студента), металеві пінцети, бинти або марля, вата гігроскопічна, папір, нитки, сірники, ножиці. Контрольні питання:
Лабораторна робота 2 Харчові потреби мікроорганізмів. Поживні середовища Харчові потреби мікроорганізмів Для свого росту й розвитку мікроорганізми потребують необхідних поживних субстратів. У природних умовах усі необхідні поживні речовини вони отримують із довкілля (ґрунтового розчину, води). В лабораторних умовах харчові потреби мікроорганізмів забезпечуються за рахунок поживних середовищ, які повинні містити макроелементи (C, O, N, H, P, S, Mg, Ca, Fe), мікроелементи (Zn, Mn, B, Cu, Mo та ін.) за необхідності – фактори росту (деякі амінокислоти, вітаміни, жирні кислоти, нуклеотиди). Різні групи мікроорганізмів відрізняються між собою за потребою в хімічних елементах та можливостях їх використання. В залежності від того, яке джерело енергії можуть використовувати прокаріоти, їх поділяють на фототрофів (джерело енергії – світло) і хемотрофів (джерело енергії – окисно-відновні реакції). Організми, для яких джерелом (донором) електронів в енергетичному процесі є неорганічні речовини, запропоновано називати літотрофами, а ті, у яких донорами електронів виступають органічні речовини – органотрофами. Тоді, в залежності від джерела енергії й природи донора електронів, можливі чотири типи енергетичного метаболізму: хемолітотрофія, хемоорганотрофія, фотолітотрофія, фотоорганотрофія. У конструктивному метаболізмі головна роль належить вуглецю, оскільки всі сполуки, з яких побудовані живі організми – це вуглецеві сполуки. В залежності від джерела вуглецю, для конструктивного метаболізму, всі прокаріоти поділяють на дві групи – автотрофи та гетеротрофи. Автотрофи (від гр. autos – сам, trophe – харчування) – переробляють вуглекислоту СО2 (яка не має енергетичної цінності) у багаті енергією речовини власного тіла. Гетеротрофи (від гр. heteros – інший) потребують готові органічні сполуки, які використовують як джерело енергії й вуглецю. Тобто харчуються за рахунок органічних субстратів синтезованих іншими організмами. Поділ мікроорганізмів у залежності від джерела енергії, донора електронів та джерела вуглецю представлено в табл. 3. Поняття гетеротрофія, досить широке й об’єднує організми, які різко відрізняються за потребами у поживних речовинах. Різниця між гетеротрофними прокаріотами з високою потребою у готових органічних сполуках і тими, потреби яких мінімальні, полягає у ступені розвинутості їх біосинтетичних властивостей. Так, до паразитів відносять мікроорганізми, які здатні жити лише за рахунок живих організмів. Паразитарний спосіб життя зумовлений відсутністю деяких метаболічних шляхів у цих прокаріот, що призвело до їх повної залежності від продуктів метаболізму хазяїна. Сапрофіти (від гр. sapros – гнилий, phyton – рослина) – потребують готові органічні сполуки, якими можуть бути гниючі рештки рослинного та тваринного походження. Деякі прокаріоти потребують одну якусь сполуку (або кілька) із групи вітамінів, амінокислот або азотистих основ, які вони з тих чи інших причин не можуть синтезувати самі. Такі сполуки називають факторами росту, а мікроорганізми, що їх потребують – ауксотрофами, на відміну від прототрофів, які синтезують всі органічні сполуки з основного джерела вуглецю. Таблиця 3 Способи існування прокаріот
Примітка: * - всі тварини та гриби; ** – вищі рослини. Азот – є одним із чотирьох основних елементів, із яких побудовані клітини. З розрахунку на сухі речовини, його вміст становить ~ 10%. У природі азот зустрічається в окисленій чи відновленій формах та у молекулярному вигляді. Переважна більшість прокаріот засвоює азот у відновленій формі (солі амонію, сечовина, органічні сполуки – амінокислоти та продукти неповного гідролізу). Багатьма прокаріотами може також використовуватись окислений азот. Дослідження потреб прокаріот у поживних елементах показало, що всі вони потребують металів, які можуть використовуватись у вигляді катіонів неорганічних солей. Деякі з них (залізо, калій, кальцій, магній) необхідні у досить великих кількостях, інші (цинк, марганець, натрій, молібден, мідь, ванадій, нікель, кобальт) – у незначних. Роль металів зумовлена тим, що вони входять до складу основних клітинних метаболітів. Таким чином, поживне середовище повинно містити всі необхідні компоненти для нормального розвитку мікроорганізмів, з урахуванням його фізіологічних особливостей. При цьому слід пам’ятати, що універсального поживного середовища не існує. Поживні середовища В лабораторних умовах мікроорганізми вирощують на поживних середовищах, які повинні відповідати певним вимогам:
Середовища, які використовуються у мікробіологічній практиці, класифікуються за походженням, консистенцією та призначенням. За походженням поживні середовища поділяють на натуральні (природні) і штучні. До натуральних середовищ відносять овочі, фрукти, рештки тварин чи рослин, молоко, води морів та річок, відвари тваринного та рослинного походження, ґрунт та ін. На натуральних середовищах добре розвивається більшість груп мікроорганізмів, так як вони містять всі компоненти, які необхідні для їх росту та розвитку. Штучні поживні середовища виготовляють у лабораторних умовах за певною рецептурою (наприклад, м’ясо-пептонний бульйон (МПБ), м’ясо-пептонний агар (МПА), середовище Чапека, середовище Ешбі, середовище Ендо та ін.). В межах штучних поживних середовищ виділяють синтетичні поживні середовища, до складу яких входять хімічно чисті речовини, взяті у певних концентраціях; та напівсинтетичні – виготовлені на основі натуральних середовищ із додаванням, деяких хімічних сполук. За консистенцією середовища поділяють на рідкі, щільні та напіврідкі. Для виготовлення рідких поживних середовищ поживні субстрати розчиняють у воді (наприклад, МПБ, пептонна вода, середовище Гісса). Щільні середовища готують на основі рідких, шляхом внесення ущільнювача. Як ущільнювач часто використовують агар-агар або інколи желатин (табл. 4). Напіврідкі середовища отримують при внесенні половинної концентрації ущільнювача. Таблиця 4 Характеристики речовин, які використовуються для ущільнення поживних середовищ
Агар-агар – складний гетерополісахарид, до складу якого входить агароза й агаропектин. Агар-агар отримують із деяких морських водоростей і випускають у вигляді пластинок або порошку. У воді він утворює гель, який плавиться при 1000 С і ущільнюється при температурі 400 С. Для ущільнення вносять у середовище 1,5-2,0% агар-агару. За призначенням поживні середовища поділяють на:
Практичне завдання:
Хід роботи (див. додаток) Матеріали та обладнання: NaCl, NaNО3, KH2PО4, KCl, MgSО4, FeSО4, K2SО4, CaCО3, сахароза, сухий порошок МПА, агар-агар, пептон, 10%-на HCl, 30%-на NaOH, вода дистильована, вода водопровідна, індикаторний папір, технічні та торсійні ваги; вата, марля, фільтрувальний папір, скляні палички, великі лійки – 2 шт., термостійкі стакани на 1 л – 2 шт., мірні циліндри на 0,5 л – 2 шт., стерильний посуд для розливу середовищ, pH-метр. Контрольні питання:
Лабораторна робота 3 Культивування мікроорганізмів у лабораторних умовах Культивування (від лат. cultus – вирощування) – це вирощування мікроорганізмів на поживних середовищах. Мікроорганізми, що розвинулись на поживному середовищі називають культурами. В лабораторних умовах мікроорганізми вирощують у рідких або на щільних поживних середовищах. Посіви проводять так, щоб у середовище не потрапили з повітря сторонні мікроорганізми. З цією метою посіви проводять поблизу газового пальника, в полум’ї якого стерилізують петлю, кінці піпеток, обпалюють краї пробок та пробірок при їх відкриванні та закриванні. Пробірки з посівами тримають у лівій руці між великим і вказівним пальцями. Ватні пробки із пробірок виймають затискуючи їх між безіменним пальцем і мізинцем правої руки. Краї відкритих пробірок і пробки тримають поблизу полум’я пальника (рис. 4).  Посів у рідке середовище проводять петлею, пастерівською або градуйованою піпеткою. Суспензію закапують безпосередньо у середовище, матеріал розтирають петлею на стінці пробірки біля поверхні середовища, а потім пробірку струшують, змиваючи посівний матеріал у середовище. Після посіву петлю обов’язково фламбують у полум’ї пальника, а піпетки занурюють у дезінфікуючий розчин. Перед посівом на щільне поживне середовище його необхідно розплавити на водяній бані, охолодити до 50-600 С і розлити у стерильні пробірки (стовпчиком або у вигляді скошеної поверхні) та чашки Петрі. Потім середовище охолоджують (ущільнюють) і підсушують. Посіви роблять бактеріальною петлею, голкою або шпателем. У першому випадку матеріал набирають стерильною петлею і зигзагоподібно наносять на поверхню скошеного агаризованого середовища. В середовище, яке розлите стовпчиком, досліджуваний матеріал засівають уколом бактеріальної голки. При посіві шпателем на поверхню середовища в чашку Петрі наносять краплю мікробної суспензії, а потім рівномірно розтирають її по всій поверхні. Для успішного вирощування мікроорганізмів необхідно забезпечити оптимальні умови культивування, які залежать від їх фізіологічних особливостей. До таких умов відносять: склад поживного середовища, аерацію, температуру та інші специфічні фактори. Інтервали температур, при яких можуть рости мікроорганізми суттєво відрізняються. В залежності від відношення до температури, мікроорганізми поділяють на:
В лабораторних умовах температурний оптимум для мікроорганізмів забезпечується їх культивуванням у термостатах. Температура у термостаті автоматично регулюється за допомогою спеціального обладнання – терморегулятора, який підтримує її на постійному рівні. Термостат – це металевий ящик із подвійними стінками, між якими знаходиться повітря або вода. В отворі верхньої стінки знаходиться термометр, який показує температуру в середині термостата, і терморегулятор. Роль терморегулятора полягає в тому, що при перевищенні встановленого рівеня температури, обігрів автоматично виключається або зменшується. Обігрів термостата забезпчується електричними тенами. За відношенням мікроорганізмів до кисню їх розподіляють на:
Способи культивування аеробних мікроорганізмів в лабораторних умовах Культивування на поверхні рідкого та щільного поживного середовища. В цьому випадку мікроорганізми отримують кисень безпосередньо з повітря. При поверхневому культивуванні важливо збільшити площу дотику середовища з повітрям. Для цього середовище наливають тонким шаром у посуд із широким дном – чашки Петрі, матраци, скошені поверхні у пробірках, колби. Глибинне культивування у рідкому середовищі. При глибинному культивуванні мікроорганізми використовують кисень, розчинений у воді. Розчинність кисню у воді не досить велика, тому, щоб забезпечити ріст аеробів у товщі рідкого середовища, його необхідно штучно аерувати. Найбільш простий спосіб аерації це струшування колб або пробірок на спеціальних качалках. При цьому відбувається збільшення поверхні дотику поживного середовища з киснем повітря. В промисловості, при вирощуванні мікроорганізмів у ферментерах, досить часто разом із механічним перемішуванням використовують ще й продування через середовище стерильного кисню. Способи культивування анаеробних мікроорганізмів ^ Рідке середовище наливають до країв пробірок чи колб. Перед використанням середовище прогрівають на водяній бані 30-40 хвилин, і швидко охолоджують, щоб не встиг розчинитись кисень. Посівний матеріал вносять на дно пробірки. Пробірки закривають гумовими або скляними пробками. Якщо ріст мікроорганізмів не супроводжується виділенням газів, поверхню середовища заливають стерильним вазеліном або парафіном. Культивування у в’язкому середовищі. Дифузія кисню у рідину зменшується зі збільшенням її в’язкості. Готують середовище з додаванням 0,5% агар-агару (ущільнювача). Вирощування у шарі щільного середовища. Посівний матеріал вносять у розплавлене та охолоджене до 45-500С агаризоване середовище. У пробірках поверхню заливають стерильною вазеліновою олією. Вирощування в анаеростатах. З анаеростатів відкачують повітря, а потім заповнюють сумішшю азоту (80-90%) та вуглекислого газу (10-20%), за рахунок якої створюється надлишковий тиск, який перешкоджає проникненню кисню з повітря. Щодо відношення мікроорганізмів до світла, то більшості мікроорганізмів воно не потрібно, за винятком фототрофних бактерій. Практичне завдання та хід роботи:
Матеріали та обладнання: Поживні середовища: МПА і пептонна вода; стерильний посуд (3 пробірки і одна чашка Петрі на студента); бактеріологічні петлі (кожному студенту); штативи; культури мікроорганізмів: Staphylococcus aureus; Micrococcus luteus; Bacillus subtilis; Serratia marcescens. Контрольні питання:
Лабораторна робота 4 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Схожі:
 | Методичні рекомендації до виконання лабораторних робіт з курсу "аналітична хімія" (якісний аналіз) Для студентів Методичні рекомендації до виконання лабораторних робіт з аналітичної хімії для студентів факультету природничих наук. Спеціальність... | | Міністерство освіти україни кременчуцький державний політехнічний університет ім. Михайла остроградського методичні рекомендації щодо проведення лабораторних Методичні рекомендації щодо проведення лабораторних робіт з дисципліни “Прикладне програмне забезпечення економіки” для студентів... |
| Методичні рекомендації до виконання лабораторних та практичних робіт із дисципліни " основи стандартизації та управління якістю продукції" Методичні рекомендації обговорено на засіданні навчально – методичної комісії інженерно – технологічного факультету (протокол №2... | | Методичні рекомендації до виконання лабораторних та практичних робіт із дисципліни " основи стандартизації та управління якістю продукції " Методичні рекомендації обговорено на засіданні навчально – методичної комісії інженерно – технологічного факультету (протокол №4... |
| Методичні рекомендації до виконання лабораторних робіт з курсу "Аналітична хімія" (кількісний аналіз) Для студентів факультету природничих наук Методичні рекомендації до виконання лабораторних робіт з аналітичної хімії (кількісний аналіз) для студентів факультету природничих... | | Методичні рекомендації до виконання лабораторних робіт з курсу "Аналітична хімія навколишнього середовища" Для студентів факультету природничих наук Методичні рекомендації до виконання лабораторних робіт з аналітичної хімії навколишнього середовища для студентів факультету природничих... |
| Методичні рекомендації щодо проведення лабораторних робіт з дисципліни " прикладне програмне забезпечення економіки" для студентів денної форми навчання зі спеціальностей Методичні рекомендації щодо проведення лабораторних робіт з дисципліни “Прикладне програмне забезпечення економіки” для студентів... | | В. Г. Короленка Історичний факультет Кафедра географії та краєзнавства Плани лабораторних занять І методичні рекомендації Плани лабораторних занять І методичні рекомендації до самостійної та індивідуальної роботи |
| Методичні вказівки до виконання лабораторних робіт Чернівці Чернівецький національний університет 2011 В – п 781 Вінклер І. А. Проблеми екологічно безпечних технологій : методичні вказівки до виконання лабораторних робіт | | Г. В. Стадник методичні вказівки Методичні вказівки до лабораторних робіт з фізичної хімії (для студентів 2-3 курсів усіх форм навчання спеціальностей 092. 601; 092.... |