Методичні рекомендації до лабораторних робіт) Київ 2001 удк 576. 8 (075. 8) icon

Методичні рекомендації до лабораторних робіт) Київ 2001 удк 576. 8 (075. 8)




НазваМетодичні рекомендації до лабораторних робіт) Київ 2001 удк 576. 8 (075. 8)
Сторінка1/7
Дата10.09.2012
Розмір1.04 Mb.
ТипМетодичні рекомендації
  1   2   3   4   5   6   7


МІЖНАРОДНИЙ СОЛОМОНІВ УНІВЕРСИТЕТ


М.Г.Сергійчук, Т.М.Фурзікова


М І К Р О Б І О Л О Г І Я

(методичні рекомендації до лабораторних робіт)





Київ - 2001




УДК 576.8 (075.8)


Сергійчук М.Г., Фурзікова Т.М. Мікробіологія (методичні рекомендації до лабораторних робіт). – Київ,____________, 66 с.


У методичних рекомендаціях представлено коротку характеристику об’єктів мікро­біології та описання основних методів роботи з мікроорганізмами. Викладені методи мік­роскопічних досліджень, принципи виготовлення поживних середовищ і культивування мікроорганізмів, способи стерилізації. Наведені рецепти реактивів, барвників та поживних середовищ, які найбільш часто використовуються у мікробіологічній практиці. Методичні рекомендації розраховані для студентів біологічних факультетів вищих учбових закладів.


Затверджено до друку

Радою Міжнародного Соломонова

університету

________________________ 2001 р.


Рецензент

кафедра мікробіології та загальної імунології Київського національного університету імені Тараса Шевченка (зав. кафедри проф. Позур В.К.)



З М І С Т



Організація мікробіологічної лабораторії. Правила роботи у мікробіологічній лабораторії. Стерилізація. Дезінфекція…..………..


4

  • Організація мікробіологічної лабораторії……………………………...

  • Правила роботи у мікробіологічній лабораторії……………………….

  • Стерилізація………………………………………………………………

4

4

5

Харчові потреби мікроорганізмів. Поживні середовища……...……....

11

  • Харчові потреби мікроорганізмів………………………………………

  • Поживні середовища…………………………………………………….

11

12

Культивування мікроорганізмів у лабораторних умовах……...……..

15

  • Способи культивування аеробних мікроорганізмів в лабораторних умовах…………………………………………………………………….

  • Способи культивування анаеробних мікроорганізмів………………...


16

16

Культуральні властивості мікроорганізмів та методи їх мікроскопічних досліджень ………………………………….….……..…


18

  • Культуральні властивості мікроорганізмів…………………………….

  • Будова оптичного мікроскопу…………………………………………..

  • Виготовлення препаратів для мікроскопії……………………………...

18

19

22

Морфологія бактерій…………..……………….…………………………..

26

Морфологічні форми грибів, дріжджів та актиноміцетів………...….

33

  • Актиноміцети…………………………………………………………….

  • Гриби……………………………………………………………………...

33

36

Ультраструктура бактеріальної клітини…..……………………………

41

Поширення мікроорганізмів у природі……………..……..…………….

52

  • Мікрофлора грунту………………………………………………………

  • Мікрофлора води………………………………………………………...

  • Мікрофлора повітря……………………………………………………...

  • Нормальна мікрофлора організму людини…………………………….

52

53

53

54

Взаємовідносини між мікроорганізмами. Антибіотики…….…………

57

Практичне використання мікроорганізмів……………………………..

60

Мікробіологія” (Програма нормативного курсу) ……………..……...

62

Додаток………………………………………………………………………

67



Лабораторна робота 1


Організація мікробіологічної лабораторії. Правила роботи у

мікробіологічній лабораторії. Стерилізація. Дезінфекція


Організація мікробіологічної лабораторії


Мікробіологічна лабораторія повинна бути ізольована від інших підрозділів і вклю­чати такі приміщення:

  1. Миєчну кімнату, де проводиться миття та висушування лабораторного посуду.

  2. Препараторську, в якій готується лабораторний посуд, реактиви та поживні середови­ща для культивування мікроорганізмів.

  3. Автоклавну (стерилізаційну), де встановлені автоклави для стерилізації лабораторного посуду, поживних середовищ та проводиться знешкодження відпрацьованого інфіко­ваного матеріалу.

  4. Матеріальну кімнату, для збереження запасу реактивів, посуду та господарського інвентарю.

  5. Лабораторну (учбову) кімнату, де проводяться мікробіологічні дослідження. Лабора­торна кімната повинна мати:

  • лабораторні столи, покриті матеріалом, який легко миється й піддається обробці дезінфікуючими розчинами. Робочі місця повинні бути обладнані газовими пальни­ками, штативами для бактеріальних петель та пробірок, дезінфікуючим розчином;

  • мікроскопи з імерсійною системою;

  • необхідний набір реактивів та барвників;

  • бактерицидні лампи.


Інші кімнати організовуються за необхідністю (центрифужна, віварій, кімната для відпочинку та ін.).


Правила роботи у мікробіологічній лабораторії


Співробітники мікробіологічних лабораторій та студенти, на лабораторних заняттях, повинні пам’ятати, що вони працюють із культурами мікро­організмів, які не завжди є нешкідливими для здоров’я людини. Тому, при роботі в мікробіологічній лабораторії, або на лабораторних заняттях з мікробіології необхідно завжди дотримуватись правил без­пеки:

  1. Працювати в лабораторії у халаті й головному уборі (косинка, шапочка).

  2. У приміщенні лабораторії не приймати їжу й воду, не допускати зайвих роз­мов і непотрібних переходів. Працювати сидячи.

  3. Користуватися лише своїм робочим місцем і прикріпленим до нього обладнан­ням.

  4. Всі посіви мають бути підписані.

  5. Під час роботи підтримувати чистоту та порядок. Всі реактиви та барвники ставити на свої місця, не класти на столи пробки від пробірок, піпетки, бакте­ріологічні петлі.

  6. Використані піпетки, предметні й покривні скельця, шпателя і т.д. поміщають у дезінфікуючий розчин. Пінцети, бактеріологічні петлі фламбують у полум’ї пальника і ставлять у штатив.

  7. Усі використані матеріали (відпрацьовані пробірки з культурами мікроорга­нізмів, інфіковані матеріали) знешкоджують в автоклаві. Ця робота викону­ється співробітниками лабораторії.

  8. Поверхню столів, одягу, взуття та інших предметів, які випадково забрудни­лися досліджуваним матеріалом (розбилася пробірка, упала крапля), дезінфі­кують.

  9. Після закінчення роботи поставити в термостат засіяні чашки й пробірки. Культури мікроорганізмів і залишки досліджуваного матеріалу необхідно зда­ти викладачеві, а робоче місце привести в порядок і продезінфікувати.

  10. Проводити вологе прибирання і періодичну дезінфекцію всіх робочих при­міщень.


Стерилізація


Стерилізація (від лат. sterilis – безплідний) – це повне знешкодження матеріалу від вегетативних клітин мікроорганізмів та їх форм спокою (спор, цист…). Для стерилізації використовують різні методи, які можна поділити на дві основні групи – фізичні та хіміч­ні.


Фізичні методи стерилізації передбачають застосування:

  1. Дії високих температур:

  • прожарювання (фламбування) у полум’ї газового пальника;

  • кип'ятіння;

  • сухим жаром у сухожарових шафах;

  • автоклавування.

  1. Стерилізації фільтруванням.

  2. Опромінення ультрафіолетовими променями.


Хімічні методи стерилізації передбачають використання бактерицидних газів та розчинів деяких хімічних речовин (спирт, сулема…).


Фізичні методи стерилізації


Дія високих температур:

  1. ^ Прожарюванням (фламбуванням) у полумї газового пальника стерилізують, безпо­середньо перед використанням, платинові петлі, голки та дрібні металеві предмети. При цьому необхідно памятати, що найвища температура спостерігається у верхній та периферійних частинах полумя пальника (рис. 1).





  1. Кип'ятінням стерилізують дрібні металеві та скляні інструменти. Початком стерилі­зації вважають момент закипання води у стерилізаторі.

  2. Стерилізацію сухим жаром проводять у спеціальних сухожарових шафах. Таким чи­ном стерилізують, в основному, лабораторний посуд, який складають у спеціальні бік­си або загортають у папір. При встановленні на сухожарових шафах температури, слід памятати, що папір та ватно-марлеві пробки обвуглюються при температурі понад 1800 С.

  3. Стерилізація автоклавуванням – це найбільш надійний та поширений спосіб стери­лізації. ЇЇ проводять за допомогою спеціальних пристроїв – автоклавів (рис. 2). В автоклавах стерилізують посуд, поживні середовища та проводять знешкодження від­працьованого матеріалу.




Автоклави можуть бути різноманітні за формою, розмірами, робочим тиском, кон­струкцією, але всі вони виконують одну і ту ж функцію – стерилізацію, і принцип їх робо­ти – практично однаковий. У верхній двостінний металевий резервуар, який герметично закривається, складають матеріал, який підлягає стерилізації. Нижній резервуар представ­ляє собою котел, який заповнюється водою. Необхідний рівень води відмічено на спеці­альній водомірній трубці автоклава. Верхній та нижній резервуари з’єднані між собою трубкою, по якій піднімається пара при закипанні води у котлі. Пара збирається у верх­ньому резервуарі і, так як він герметично закритий, в ньому створюється надлишок тиску. Для того щоб надлишковий тиск не перевищував дозволеної межі, верхній резервуар осна­щено спеціальним паровивідним клапаном. Автоклав обов’язково має два манометри, на одному – встановлюється необхідний для стерилізації тиск, інший – показує поточний тиск у стерилізаційній камері. Як тільки стрілка манометра доходить встановленої поз­начки, автоматично відкривається паровипускний клапан і надлишок пари виходить із стерилізаційної камери.

В мікробіологічній практиці стерилізація в автоклаві здійснюється при температурі в межах від 1120 С до 1340 С, тобто від 0,5 до 2,0 атм. Температура нижче 1120 С не є надій­ною, а вище 1340 С – не є необхідною. Показнику манометра, у фізичних атмосферах, від­повідає певна температура (таб. 1).

Температура й тривалість автоклавування визначаються матеріалом, який стерилізу­ється. Поживні середовища, які містять молоко, желатин, пивне сусло, дріжджовий авто­лізат, вітаміни, цукри стерилізують при 0,5 атм. протягом 15-30 хв. Загальновживані по­живні середовища стерилізуються при 1,0 атм. Але є субстрати, які характеризуються особливою термостабільністю (наприклад, ґрунт), Такі субстрати стерилізують при 2,0 атм. протягом 1-2 год два дні підряд.


^ Таблиця 1

Температура насиченої пари при різному тиску



Тиск:

Температура,

0С

нормальний,

атм

надлишковий, атм

1,0

-

110

1,0

0,5

112

1,0

0,75

116

1,0

1,0

121

1,0

1,5

126

1,0

2,0

134

1,0

2,5

138


Для середовищ, складові яких руйнуються при температурі вище 1000 С, проводять поетапну (дрібну) стерилізацію, яку можна здійснювати в автоклаві з відкритим парови­пускним клапаном (стерилізація текучою парою). Принцип такої стерилізації полягає в тому, що середовище (чи його компоненти) прогрівається без надлишкового тиску (при 1000 С) декілька разів, а в періоди між прогріваннями дають можливість прорости життєздатним спорам. Обробку текучою парою проводять 3-4 рази протягом 20-40 хв.


Різновидом дрібної стерилізації є тиндалізація. Використовується для середовищ, компоненти яких денатуруються при 600 С. Матеріал, який стерилізується прогрівають на водяних банях та апаратах Коха 5-6 разів, із перервою для переходу спорових форм мік­роорганізмів у вегетативні.


Одноразовий прогрів матеріалу при температурі нижче 1000 С, направлений на зни­щення лише вегетативних клітин мікроорганізмів, називають пастеризацією. Вона, як правило, не забезпечує стерильності. В результаті пастеризації гине до 90-95% мікро­флори. Ті ж клітини, які залишилися – ослаблені і розмножуються повільніше. Пастер­изація широко використовується у харчовій промисловості для обробки продуктів, які швидко втрачають (змінюють) свої смакові і харчові властивості при розвитку в них мікроорганізмів: молоко, ягідні та фруктові соки, вина, пиво та ін. Пастеризацію прово­дять при 60-750 С протягом 15-30 хв або при 800 С – 10-15 хв (у деяких випадках матеріал нагрівають до 900 С) із наступним швидким охолодженням до температури нижче 100 С.


Стерилізація фільтруванням використовується для обробки поживних середовищ та розчинів, компоненти яких розкладаються під дією температури. Метод полягає у пропус­канні (фільтрації) розчинів через дрібнопористі фільтри (табл. 2). Мікробні клітини затри­муються на фільтрах механічно, так як вони більші, ніж діаметр пор фільтру. В залежності від матеріалу, із якого виготовлено фільтр, розрізняють мембранні (колоїдні), азбестові, фарфо­рові, скляні фільтри.

Фільтрування проводять за допомогою спеціальних приладів (фільтри Зейтца, свіча Шамберлана) (рис. 3). Механізм роботи цих приладів принципово подібний. Верхній отвір стерильної колби покривається мікропористим фільтром, через який пропускається рідина, яку треба простерилізувати. Але пори фільтра настільки малі, що ця рідина не здатна про­ходити крізь них самостійно, для цього необхідно створити різницю тисків ззовні колби та в середині. За допомогою спеціального насоса у колбі створюється вакуум і простерилізо­вана, таким чином, рідина збирається у колбі.


Таблиця 2

Характеристика мембранних фільтрів “Сінпор”


Позначення (№)

фільтра

Діаметр

пор, мкм

Варіації діаметра

пор, + мкм

1

4,0

1,0

2

2,5

0,5

3

1,5

0,4

4

0,85

0,15

5

0,60

0,10

6

0,40

0,06

7

0,30

0,04

8

0,23

0,03

9

0,17

0,03

10

0,12

0,02





Опромінення ультрафіолетовими променями використовується, як правило, для обробки повітря в кімнатах, які потребують особливої чистоти.


Хімічні методи стерилізації


Хімічна стерилізація (дезінфекція) – це знищення мікроорганізмів та їх спор за до­помогою хімічних речовин (антисептиків). Найчастіше дезінфекцію проводять для зни­щення патогенних форм мікроорганізмів у навколишньому середовищі. Як дезінфікуючі агенти використовують:

  1. Галогени (хлор, йод) та їх похідні. Хлор та йод активні проти вегетативних та спо­рових форм мікроорганізмів.

  2. Сполуки важких металів (ртуть, срібло, мідь). Так як сполуки ртуті високотоксичні, а срібла – коштовні, їх використовують дуже рідко. Крім того, ці сполуки здійснюють переважно бактеріостатичну, а не бактерицидну дію.

  3. Фенольні сполуки. Фенол здійснює дезінфікуючий вплив як на вегетативні клітини, так і на спори, тоді як його сполуки неефективні проти спор.

  4. Спирти (етиловий та ізопропіловий). Їх дезінфікуючі властивості зростають прямо пропорційно концентрації, від 500 до 700. При більш високих концентраціях їх бак­терицидна дія різко знижується. Спирти не здійснюють летального впливу на спори бактерій і мають повільний дезінфікуючий ефект (декілька хвилин).

  5. Мікробоцидні гази. Формальдегід – максимальний стерилізаційний ефект досягається при вологості повітря 70% і температурі 220 С. При більш низькій температурі він втрачає свій дезінфікуючий ефект. Оксидом етилену обробляють термолабільні сере­довища та пластмасовий посуд. Оксид етилену летка сполука і виділяється з оброб­леного матеріалу при температурі 370 С.

  6. Консерванти додають до середовищ та матеріалів, які підлягають тривалому збері­ганню.


Окремо можна виділити біологічну стерилізацію, яку здатні здійснювати антибіотич­ні речовини та фітонциди.


Практичне завдання:


  1. Ознайомитися із приміщеннями учбової мікробіологічної лабораторії, охороною праці та технікою безпеки.

  2. Виготовити ватно-марлеві пробки для бактеріологічних пробірок та колб.

  3. Виготовити скляні шпателі.

  4. Підготувати для стерилізації лабораторний посуд: пробірки, чашки Петрі, піпетки та колби.


Хід роботи:


  1. Ватно-марлеві пробки можна виготовляти вручну або за допомогою спеціальних ма­шин. Правильно виготовлена пробка повинна легко (але щільно) входити у колбу (пробірку). При різкому вийманні такої пробки відчувається легенький хлопок.

  2. Шпателі для мікробіологічних досліджень краще виготовляти зі скляних паличок дов­жиною 18-20 см і товщиною 0,4 см.

  3. При підготовці до стерилізації бактеріологічні пробірки (чисті та висушені) закри­вають ватно-марлевими пробками, а потім загортають по 20-25 штук у папір. Чашки Петрі загортають у папір по 1-3 штуці.


Матеріали та обладнання:


Піпетки об’ємом 1 мл, 2 мл та 5 мл (по дві на кожного студента), піпетки об’ємом 1 мл, 2 мл та 5 мл (по дві на кожного студента), чашки Петрі (по дві на кожного студента), колби різних розмірів, скляні палички (по дві на кожного студента), бактеріологічні про­бірки (по дві на кожного студента), металеві пінцети, бинти або марля, вата гігроскопічна, папір, нитки, сірники, ножиці.


Контрольні питання:


  1. Які кімнати повинна містити мікробіологічна лабораторія?

  2. Які методи стерилізації ви знаєте?

  3. Які режими використовують при стерилізації в автоклаві?

  4. Яка будова автоклава?

  5. У чому полягає суть хімічних методів стерилізації?

  6. Що таке стерилізація, дезінфекція, пастеризація? Чим вони відрізняються між собою?



Лабораторна робота 2


Харчові потреби мікроорганізмів. Поживні середовища


Харчові потреби мікроорганізмів


Для свого росту й розвитку мікроорганізми потребують необхідних поживних суб­стратів. У природних умовах усі необхідні поживні речовини вони отримують із довкілля (ґрунтового розчину, води). В лабораторних умовах харчові потреби мікроорганізмів за­безпечуються за рахунок поживних середовищ, які повинні містити макроелементи (C, O, N, H, P, S, Mg, Ca, Fe), мікроелементи (Zn, Mn, B, Cu, Mo та ін.) за необхідності – фактори росту (деякі амінокислоти, вітаміни, жирні кислоти, нуклеотиди).

Різні групи мікроорганізмів відрізняються між собою за потребою в хімічних еле­ментах та можливостях їх використання.

В залежності від того, яке джерело енергії можуть використовувати прокаріоти, їх поділяють на фототрофів (джерело енергії – світло) і хемотрофів (джерело енергії – окисно-відновні реакції). Організми, для яких джерелом (донором) електронів в енерге­тичному процесі є неорганічні речовини, запропоновано називати літотрофами, а ті, у яких донорами електронів виступають органічні речовини – органотрофами. Тоді, в залежності від джерела енергії й природи донора електронів, можливі чотири типи енер­гетичного метаболізму: хемолітотрофія, хемоорганотрофія, фотолітотрофія, фотооргано­трофія.

У конструктивному метаболізмі головна роль належить вуглецю, оскільки всі спо­луки, з яких побудовані живі організми – це вуглецеві сполуки. В залежності від джерела вуглецю, для конструктивного метаболізму, всі прокаріоти поділяють на дві групи – автотрофи та гетеротрофи.

Автотрофи (від гр. autos – сам, trophe – харчування) – переробляють вуглекислоту СО2 (яка не має енергетичної цінності) у багаті енергією речовини власного тіла.

Гетеротрофи (від гр. heteros – інший) потребують готові органічні сполуки, які ви­користовують як джерело енергії й вуглецю. Тобто харчуються за рахунок органічних суб­стратів синтезованих іншими організмами.

Поділ мікроорганізмів у залежності від джерела енергії, донора електронів та джерела вуглецю представлено в табл. 3.

Поняття гетеротрофія, досить широке й об’єднує організми, які різко відрізняються за потребами у поживних речовинах. Різниця між гетеротрофними прокаріотами з висо­кою потребою у готових органічних сполуках і тими, потреби яких мінімальні, полягає у ступені розвинутості їх біосинтетичних властивостей.

Так, до паразитів відносять мікроорганізми, які здатні жити лише за рахунок живих організмів. Паразитарний спосіб життя зумовлений відсутністю деяких метаболічних шля­хів у цих прокаріот, що призвело до їх повної залежності від продуктів метаболізму ха­зяїна.

Сапрофіти (від гр. sapros – гнилий, phyton – рослина) – потребують готові органічні сполуки, якими можуть бути гниючі рештки рослинного та тваринного походження.

Деякі прокаріоти потребують одну якусь сполуку (або кілька) із групи вітамінів, амінокислот або азотистих основ, які вони з тих чи інших причин не можуть синтезувати самі. Такі сполуки називають факторами росту, а мікроорганізми, що їх потребують – ауксотрофами, на відміну від прототрофів, які синтезують всі органічні сполуки з основ­ного джерела вуглецю.


Таблиця 3

Способи існування прокаріот


Дж. енергії

Донор електронів

Дж. вуглецю

Спосіб існування

Представники прокаріот

Окисно-відновні реакції

неорг.сп-ки (H2, H2S,Fe2+, NH3)

2

хемолітоавтотрофія

нітріфікуючі, тіонові, водневі бактерії

органічні сполуки

хемолітогетеротрофія

метанутворюючі, водневі бактерії

орг. сп-ки

CO2

хемоорганоавтотрофія

факультативні метилотрофи, які окислюють мурашкову кис-ту

органічні сполуки

хемоорганогетеротрофія

більшість прокаріот*

Світло

неорг. сп-ки (H2O, H2S, S)

CO2

фотолітоавтотрофія

ціано-, пурпурні та зелені бактерії**

органічні сполуки

фотолітогетеротрофія

деякі ціано-, пурпурні та зелені бактерії,

орг. сп-ки

CO2

фотоорганоавтотрофія

деякі пурпурні бактерії

органічні сполуки

фотоорганогетеротрофія

пурпурні та деякі зелені, гало- і ціанобактерії

Примітка: * - всі тварини та гриби; ** – вищі рослини.


Азот – є одним із чотирьох основних елементів, із яких побудовані клітини. З розра­хунку на сухі речовини, його вміст становить ~ 10%. У природі азот зустрічається в окис­леній чи відновленій формах та у молекулярному вигляді. Переважна більшість прокаріот засвоює азот у відновленій формі (солі амонію, сечовина, органічні сполуки – амінокис­лоти та продукти неповного гідролізу). Багатьма прокаріотами може також використову­ватись окислений азот.

Дослідження потреб прокаріот у поживних елементах показало, що всі вони потре­бують металів, які можуть використовуватись у вигляді катіонів неорганічних солей. Деякі з них (залізо, калій, кальцій, магній) необхідні у досить великих кількостях, інші (цинк, марганець, натрій, молібден, мідь, ванадій, нікель, кобальт) – у незначних. Роль металів зумовлена тим, що вони входять до складу основних клітинних метаболітів.

Таким чином, поживне середовище повинно містити всі необхідні компоненти для нормального розвитку мікроорганізмів, з урахуванням його фізіологічних особливостей. При цьому слід пам’ятати, що універсального по­живного середовища не існує.


Поживні середовища


В лабораторних умовах мікроорганізми вирощують на поживних середовищах, які повинні відповідати певним вимогам:

  • бути поживними, тобто вони повинні задовольняти всі необхідні харчові потреби мікроорганізмів;

  • містити необхідну кількість води;

  • мати певні значення pH та Eh;

  • бути ізотонічними;

  • бути стерильними;

  • бути прозорими.


Середовища, які використовуються у мікробіологічній практиці, класифікуються за походженням, консистенцією та призначенням.


За походженням поживні середовища поділяють на натуральні (природні) і штучні. До натуральних середовищ відносять овочі, фрукти, рештки тварин чи рослин, молоко, води морів та річок, відвари тваринного та рослинного походження, ґрунт та ін. На на­туральних середовищах добре розвивається більшість груп мікроорганізмів, так як вони міс­тять всі компоненти, які необхідні для їх росту та розвитку. Штучні поживні середовища виготовляють у лабораторних умовах за певною рецептурою (наприклад, мясо-пептонний бульйон (МПБ), мясо-пептонний агар (МПА), середовище Чапека, середовище Ешбі, середовище Ендо та ін.). В межах штучних поживних середовищ виділяють синтетичні поживні середовища, до складу яких входять хімічно чисті речовини, взяті у певних концентраціях; та напівсинтетичні – виготовлені на основі натуральних середовищ із додаванням, деяких хімічних сполук.


За консистенцією середовища поділяють на рідкі, щільні та напіврідкі. Для виго­товлення рідких поживних середовищ поживні субстрати розчиняють у воді (наприклад, МПБ, пептонна вода, середовище Гісса). Щільні середовища готують на основі рідких, шляхом внесення ущільнювача. Як ущільнювач часто використовують агар-агар або інко­ли желатин (табл. 4). Напіврідкі середовища отримують при внесенні половинної концен­трації ущільнювача.


Таблиця 4

Характеристики речовин, які використовуються для ущільнення

поживних середовищ


Показник

Агар-агар

Желатин

- матеріал для отримання

- основні компоненти

- температура плавлення

- температура ущільнення

- дія протеаз

- конденсаційна вода

- робоча концентрація

морські водорості

полісахариди

не манше 800 С

30-400 С

не діють

виділяється

1,0-3,3%

шкіра, кістки, хрящі

білки

10% розчину 320 С

22-250 С

діють

не виділяється

10-20%


Агар-агар – складний гетерополісахарид, до складу якого входить агароза й агаро­пектин. Агар-агар отримують із деяких морських водоростей і випускають у вигляді пластинок або порошку. У воді він утворює гель, який плавиться при 1000 С і ущіль­нюється при температурі 400 С. Для ущільнення вносять у середовище 1,5-2,0% агар-ага­ру.


За призначенням поживні середовища поділяють на:

  • загальновживані середовища, на яких ростуть і розвиваються представники різ­них груп мікроорганізмів (наприклад, МПА, МПБ, пептонна вода). Вони викорис­товуються для культивування мікроорганізмів та накопичення біомаси;

  • середовища спеціального призначення, серед яких виділяють:

  1. Елективні середовища, які забезпечують розвиток певних груп мікроорганізмів (нап­риклад, середовища, які не містять звязаних форм азоту – для виділення азотфіксу­ючих бактерій).

  2. Селективні середовища призначені для селекції мікроорганізмів за певною ознакою (наприклад, стійкість до антибіотика).

  3. Диференційно-діагностичні поживні середовища (індикаторні) дають можливість швидко відрізнити одні види мікроорганізмів від інших або виявити деякі їх особли­вості. Наприклад, середовище Ендо, яке дозволяє виявити наявність клітин Escherichia coli у природних субстратах, так як лише E. coli на цьому середовищі утворює колонії рожевого кольору з металевим блиском.



Практичне завдання:


  1. Виготовити поживні середовища:

  • пептонну воду – 100 мл;

  • м’ясо-пептонний агар (МПА) – 500 мл;

  • середовище Чапека – 200 мл;

  • середовище Ешбі – 200 мл.


Хід роботи (див. додаток)


Матеріали та обладнання:


NaCl, NaNО3, KH24, KCl, MgSО4, FeSО4, K24, CaCО3, сахароза, сухий порошок МПА, агар-агар, пептон, 10%-на HCl, 30%-на NaOH, вода дистильована, вода водо­провідна, індикаторний папір, технічні та торсійні ваги; вата, марля, фільтрувальний па­пір, скляні палички, великі лійки – 2 шт., термостійкі стакани на 1 л – 2 шт., мірні циліндри на 0,5 л – 2 шт., стерильний посуд для розливу середовищ, pH-метр.


Контрольні питання:


  1. Назвіть макро- та мікроелементи, які повинно містити поживне середовище.

  2. Що таке фактори росту та за яких умов їх додають у поживне середовище?

  3. На які групи поділяють мікроорганізми в залежності від джерела вуглецю?

  4. Що являє собою агар-агар та які його фізичні характеристики?

  5. Чому желатин має обмежене використання для ущільнення поживних середовищ?

  6. Яким вимогам повінні відповідати поживні середовища?

  7. Як класифікують поживні середовища в залежності від походження, призначення та консистенції?



Лабораторна робота 3


Культивування мікроорганізмів у лабораторних умовах


Культивування (від лат. cultus – вирощування) – це вирощування мікроорганізмів на поживних середовищах. Мікроорганізми, що розвинулись на поживному середовищі називають культурами.

В лабораторних умовах мікроорганізми вирощують у рідких або на щільних пожив­них середовищах. Посіви проводять так, щоб у середовище не потрапили з повітря сто­ронні мікроорганізми. З цією метою посіви проводять поблизу газового пальника, в полумї якого стерилізують петлю, кінці піпеток, обпалюють краї пробок та пробірок при їх відкриванні та закриванні.

Пробірки з посівами тримають у лівій руці між великим і вказівним пальцями. Ватні пробки із пробірок виймають затискуючи їх між безіменним пальцем і мізинцем правої руки. Краї відкритих пробірок і пробки тримають поблизу полумя пальника (рис. 4).





Посів у рідке середовище проводять петлею, пастерівською або градуйованою піпет­кою. Суспензію закапують безпосередньо у середовище, матеріал розтирають петлею на стінці пробірки біля поверхні середовища, а потім пробірку струшують, змиваючи посівний матеріал у середовище. Після посіву петлю обов’язково фламбують у полум’ї пальника, а піпетки занурюють у дезінфікуючий розчин.

Перед посівом на щільне поживне середовище його необхідно розплавити на водяній бані, охолодити до 50-600 С і розлити у стерильні пробірки (стовпчиком або у вигляді ско­шеної поверхні) та чашки Петрі. Потім середовище охолоджують (ущільнюють) і підсу­шують. Посіви роблять бактеріальною петлею, голкою або шпателем.

У першому випадку матеріал набирають стерильною петлею і зигзагоподібно нано­сять на поверхню скошеного агаризованого середовища. В середовище, яке розлите стов­пчиком, досліджуваний матеріал засівають уколом бактеріальної голки. При посіві шпате­лем на поверхню середовища в чашку Петрі наносять краплю мікробної суспензії, а потім рівномірно розтирають її по всій поверхні.

Для успішного вирощування мікроорганізмів необхідно забезпечити оптимальні умови культивування, які залежать від їх фізіологічних особливостей. До таких умов від­носять: склад поживного середовища, аерацію, температуру та інші специфічні фактори.

Інтервали температур, при яких можуть рости мікроорганізми суттєво відрізняються. В залежності від відношення до температури, мікроорга­нізми поділяють на:

  • мезофіли – ростуть в діапазоні температур 20-400 С. Для водних та ґрунтових мікроорганізмів температурний оптимум 20-300 С. Для бактерій шкіри та слизових оболонок кишок– 35-380 С;

  • термофіли – ростуть при температурі вище 450 С;

  • психрофіли – ростуть при температурі нижче 200 С. Оптимум 5-100 С.


В лабораторних умовах температурний оптимум для мікроорганізмів забезпечується їх культивуванням у термостатах. Температура у термостаті автоматично регулюється за допомогою спеціального обладнання – терморегулятора, який підтримує її на постійному рівні. Термостат – це металевий ящик із подвійними стінками, між якими знаходиться по­вітря або вода. В отворі верхньої стінки знаходиться термометр, який показує температуру в середині термостата, і терморегулятор. Роль терморегулятора полягає в тому, що при пе­ревищенні встановленого рівеня температури, обігрів автоматично виключається або зменшується. Обігрів термостата забезпчується електричними тенами.


За відношенням мікроорганізмів до кисню їх розподіляють на:

  • аероби – життєдіяльність яких відбувається за рахунок окислення речовин киснем повітря;

  • анаероби – отримують кисень при анаеробному розщепленні складних органічних сполук. Атмосферний кисень при цьому смертельний;

  • мікроаерофіли (факультативні аероби та анаероби) – потребують умов із зниженим рівнем кисню.


Способи культивування аеробних мікроорганізмів

в лабораторних умовах


Культивування на поверхні рідкого та щільного поживного середовища. В цьому випадку мікроорганізми отримують кисень безпосередньо з повітря. При поверхневому культивуванні важливо збільшити площу дотику середовища з повітрям. Для цього сере­довище наливають тонким шаром у посуд із широким дном – чашки Петрі, матраци, ско­шені поверхні у пробірках, колби.

Глибинне культивування у рідкому середовищі. При глибинному культивуванні мікроорганізми використовують кисень, розчинений у воді. Розчинність кисню у воді не досить велика, тому, щоб забезпечити ріст аеробів у товщі рідкого середовища, його необ­хідно штучно аерувати. Найбільш простий спосіб аерації це струшування колб або про­бірок на спеціальних качалках. При цьому відбувається збільшення поверхні дотику по­живного середовища з киснем повітря. В промисловості, при вирощуванні мікроорга­нізмів у ферментерах, досить часто разом із механічним перемішуванням використовують ще й продування через середовище стерильного кисню.


Способи культивування анаеробних мікроорганізмів


^ Вирощування у високому шарі середовища. Рідке середовище наливають до країв пробірок чи колб. Перед використанням середовище прогрівають на водяній бані 30-40 хвилин, і швидко охолоджують, щоб не встиг розчинитись кисень. Посівний матеріал вносять на дно пробірки. Пробірки закривають гумовими або скляними пробками. Якщо ріст мікроорганізмів не супроводжується виділенням газів, поверхню середовища зали­вають сте­рильним вазеліном або парафіном.

Культивування у в’язкому середовищі. Дифузія кисню у рідину зменшується зі збільшенням її вязкості. Готують середовище з додаванням 0,5% агар-агару (ущільнюва­ча).

Вирощування у шарі щільного середовища. Посівний матеріал вносять у розплав­лене та охолоджене до 45-500С агаризоване середовище. У пробірках поверхню заливають стерильною вазеліновою олією.

Вирощування в анаеростатах. З анаеростатів відкачують повітря, а потім запов­нюють сумішшю азоту (80-90%) та вуглекислого газу (10-20%), за рахунок якої створю­ється надлишковий тиск, який перешкоджає проник­ненню кисню з повітря.


Щодо відношення мікроорганізмів до світла, то більшості мікроорганізмів воно не потрібно, за винятком фототрофних бактерій.


Практичне завдання та хід роботи:


  1. Розплавити щільні поживні середовища.

  2. Розлити поживні середовища:

  • пептонну воду у пробірки;

  • МПА у пробірки (стовпчиком та у вигляді скошеної поверхні) та чашки Петрі.

  1. Засіяти:

  • штрихом на чашку Петрі з МПА – Staphylococcus aureus;

  • штрихом у пробірку зі скошеним МПА – Micrococcus luteus;

  • уколом в стовпчик у пробірку з МПА – Serratia marcescens;

  • піпеткою у пробірку з пептонною водою – Bacillus subtilis.


Матеріали та обладнання:


Поживні середовища: МПА і пептонна вода; стерильний посуд (3 пробірки і одна чашка Петрі на студента); бактеріологічні петлі (кожному студенту); штативи; культури мікроорганізмів: Staphylococcus aureus; Micrococcus luteus; Bacillus subtilis; Serratia marces­cens.


Контрольні питання:


  1. Які умови необхідно забезпечити для нормального вирощування мікроорганізмів?

  2. На які групи поділяються мікроорганізми в залежності від відношення до температу­ри?

  3. Як забезпечити вирощування аеробних та анаеробних форм мікроорганізмів?

  4. Яка техніка посіву на рідкі та щільні поживні середовища?



Лабораторна робота 4


  1   2   3   4   5   6   7

Схожі:

Методичні рекомендації до лабораторних робіт) Київ 2001 удк 576. 8 (075. 8) iconМетодичні рекомендації до виконання лабораторних робіт з курсу "аналітична хімія" (якісний аналіз) Для студентів
Методичні рекомендації до виконання лабораторних робіт з аналітичної хімії для студентів факультету природничих наук. Спеціальність...
Методичні рекомендації до лабораторних робіт) Київ 2001 удк 576. 8 (075. 8) iconМіністерство освіти україни кременчуцький державний політехнічний університет ім. Михайла остроградського методичні рекомендації щодо проведення лабораторних
Методичні рекомендації щодо проведення лабораторних робіт з дисципліни “Прикладне програмне забезпечення економіки” для студентів...
Методичні рекомендації до лабораторних робіт) Київ 2001 удк 576. 8 (075. 8) iconМетодичні рекомендації до виконання лабораторних та практичних робіт із дисципліни " основи стандартизації та управління якістю продукції"
Методичні рекомендації обговорено на засіданні навчально – методичної комісії інженерно – технологічного факультету (протокол №2...
Методичні рекомендації до лабораторних робіт) Київ 2001 удк 576. 8 (075. 8) iconМетодичні рекомендації до виконання лабораторних та практичних робіт із дисципліни " основи стандартизації та управління якістю продукції "
Методичні рекомендації обговорено на засіданні навчально – методичної комісії інженерно – технологічного факультету (протокол №4...
Методичні рекомендації до лабораторних робіт) Київ 2001 удк 576. 8 (075. 8) iconМетодичні рекомендації до виконання лабораторних робіт з курсу "Аналітична хімія" (кількісний аналіз) Для студентів факультету природничих наук
Методичні рекомендації до виконання лабораторних робіт з аналітичної хімії (кількісний аналіз) для студентів факультету природничих...
Методичні рекомендації до лабораторних робіт) Київ 2001 удк 576. 8 (075. 8) iconМетодичні рекомендації до виконання лабораторних робіт з курсу "Аналітична хімія навколишнього середовища" Для студентів факультету природничих наук
Методичні рекомендації до виконання лабораторних робіт з аналітичної хімії навколишнього середовища для студентів факультету природничих...
Методичні рекомендації до лабораторних робіт) Київ 2001 удк 576. 8 (075. 8) iconМетодичні рекомендації щодо проведення лабораторних робіт з дисципліни " прикладне програмне забезпечення економіки" для студентів денної форми навчання зі спеціальностей
Методичні рекомендації щодо проведення лабораторних робіт з дисципліни “Прикладне програмне забезпечення економіки” для студентів...
Методичні рекомендації до лабораторних робіт) Київ 2001 удк 576. 8 (075. 8) iconВ. Г. Короленка Історичний факультет Кафедра географії та краєзнавства Плани лабораторних занять І методичні рекомендації
Плани лабораторних занять І методичні рекомендації до самостійної та індивідуальної роботи
Методичні рекомендації до лабораторних робіт) Київ 2001 удк 576. 8 (075. 8) iconМетодичні вказівки до виконання лабораторних робіт Чернівці Чернівецький національний університет 2011
В – п 781 Вінклер І. А. Проблеми екологічно безпечних технологій : методичні вказівки до виконання лабораторних робіт
Методичні рекомендації до лабораторних робіт) Київ 2001 удк 576. 8 (075. 8) iconГ. В. Стадник методичні вказівки
Методичні вказівки до лабораторних робіт з фізичної хімії (для студентів 2-3 курсів усіх форм навчання спеціальностей 092. 601; 092....
Додайте кнопку на своєму сайті:
Документи


База даних захищена авторським правом ©zavantag.com 2000-2013
При копіюванні матеріалу обов'язкове зазначення активного посилання відкритою для індексації.
звернутися до адміністрації
Документи